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PCR常见问题

点击次数:262   发布时间:2021/11/9 21:44:02

                                                                         PCR常见问题
                                                               圣宾仪器科技上海有限公司
问题1:假阴性(无扩增产物)
现象:正对照有条带,样品无条带
可能原因:
模板:含有Taq酶抑制剂、杂蛋白,模板上样量低或模板降解
引物:引物降解,引物设计不合理
试剂:酶失活,buffer不合适
反应条件:退火温度高,延伸时间短
解决方法:
纯化模板并重新提取,并检测模板是否含有抑制剂
重新设计引物并低温保存
优化buffer,摸索镁离子浓度或适当加入DMSO(小于0.3%)
降低退火温度,增加延伸时间(反应条件参照试剂盒说明书)
问题2:假阳性
现象:空白对照出现条带
可能原因:
引物设计不适,与目的序列具有同源性
试剂污染:水、移液枪等被核酸污染
样品间出现交叉污染
解决方法:
实验仪器高压灭菌
实验试剂(酶除外)高压灭菌,离心管枪头一次性使用
规范实验操作
假阳性可通过巢式PCR解决,或者使用特异性较高的试剂盒扩增
问题3:拖尾、弥散
现象:电泳出现拖尾、涂抹带
可能原因:
酶用量过多
模板纯度较低
dNTP、镁离子浓度过高
循环次数过多
解决方法:
减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增
纯化模板
减少dNTP用量,摸索镁离子浓度
减少循环次数
问题4:二聚体及非特异性产物
一般小于100bp的条带可基本判断为引物二聚体
主要原因:
引物设计不合理,引物自身具有互补性
引物浓度不适
镁离子浓度过高,退火温度过低
解决方法:
重新设计引物并进行BLAST检测
降低镁离子浓度,提高退火温度
增加模板用量
提高PCR反应特异性的方法
引物的设计
引物在模板cDNA的保守区设计,长度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超过连续三个G或C,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行BLAST检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。
降落PCR
降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使PCR效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高PCR的特异性和效率。
热启动扩增
采用热启动方法进行扩增,是除了设计引物之外,提高PCR反应特异性的方式。在一般的PCR反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将PCR仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有DNA链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之抑制酶的活性,而有效的方法就是使用热启动酶或高保真酶去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到95℃时恢复活性,指导扩增。
巢式PCR
采用巢式PCR进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是,它采用两对引物进行扩增,先用对引物普通PCR,然后将轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。
                                                                                                                                                            本篇转载至实验之家

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